ENZIM

Pengertian Enzim     

Enzim adalah biomolekul yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia. Hampir semua enzim merupakan protein. Pada reaksi yang dikatalisasi oleh enzim, molekul awal reaksi disebut sebagai substrat, dan enzim mengubah molekul tersebut menjadi molekul-molekul yang berbeda, disebut produk. Hampir semua proses biologis sel memerlukan enzim agar dapat berlangsung dengan cukup cepat.

Enzim bekerja pada perangkat substrat (reaktan) dan mengubahnya menjadi suatu perangkat hasil (produk). Daerah pada enzim yang mengikat suatu substrat adalah sisi aktif (tempat aktif). Tingkat kekhususan yang tinggi memungkinkan sel mengendalikan reaksi-reaksi metabolisme dengan mengatur bentuk dan jumlah enzim yang dihasilkan.

Beberapa enzim bersifat sangat spesifik, yaitu hanya mengkatalis suatu reaksi kimia tertentu. Tetapi pada umumnya enzim tidak begitu spesifik dan akan menguraikan zat-zat lain yang mesih berkerabat (berhubungan), misalnya lipase yang dapat bekerja pada sejumlah besar lemak.

Konvensi penamaan

Nama enzim sering kali diturunkan dari nama substrat ataupun reaksi kimia yang ia kataliskan dengan akhiran -ase. Contohnya adalah laktase, alkohol dehidrogenase, dan DNA polimerase.

International Union of Biochemistry and Molecular Biology telah mengembangkan suatu tatanama untuk enzim, yang disebut sebagai nomor EC; tiap-tiap enzim memiliki empat digit nomor urut sesuai dengan ketentuan klasifikasi yang berlaku. Nomor pertama untuk klasifikasi teratas enzim didasarkan pada ketentuan beriktu:

EC 1 Oksidoreduktase: mengkatalisis reaksi oksidasi/reduksis

EC 2 Transferase: mentransfer gugus fungsi

EC 3 Hidrolase: mengkatalisis hidrolisis berbagai ikatan

EC 4 Liase: memutuskan berbagai ikatan kimia selain melalui hidrolisis dan oksidasi

EC 5 Isomerase: mengkatalisis isomerisasi sebuah molekul tunggal

EC 6 Ligase: menggabungkan dua molekul secara ikatan kovalen

Tata nama secara lengkap dapat dilihat di http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/ (Bahasa Inggris).

Ciri-ciri enzim yaitu sebagai berikut:

1.      Enzim terbina daripada protein yang dihasilkan oleh sel hidup.

2.      Tindakan enzim spesifik. Setiap jenis enzim hanya bertindak balas dengan substrat tertentu sahaja. Contoh: enzim sukrase hanya boleh berindak balas dengan sukrosa tetapi tidak boleh bertindak balas dengan maltosa walaupun kedua-duanya adalah gula.

3.      Tindak balas enzim boleh berbalik. Arah tindak balas bergantung kepada jumlah substrat dan hasil yang ada. Tindak balas penguraian lemak akan berlaku dari kiri ke kanan atau dari kanan ke kiri sehingga keseimbangan tercapai antara kedua-dua substrat.

4.      Enzim diperlukan dalam kuantitas yang kecil. Sedikit enzim akan memangkinkan satu bilangan besar tindak balas biokimia yang sama.

5.      Enzim tidak boleh dimusnahkan selepas tindak balas biokimia selesai. Oleh itu, enzim boleh digunakan berulang kali.

Cara kerja enzim ada dua yaitu:

Model kunci gembok, enzim dimisalkan sebagai sebuah gembok karena memiliki sebuah bagian kesil yang dapat berikatan dengan substrat. Bagian tersebut disebut sisi aktif. Substrat dimisalkan sebagai kunci karena dapat berikatan secara pas dengan sisi aktif enzim.

Induksi pas, pada model ini, sisi aktif enzim dapat berubah bentuk sesuai dengan berbentuk substrat.

Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim:

a)      Temperatur,

Enzim juga dapat dipengaruhi oleh suhu maka reaksi yang menggunakan katalis enzim yang dapat  dipengaruhi oleh suhu. Pada suhu rendah reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi reaksi berlangsung lebih cepat. Disamping itu karena enzim itu adalah suatu protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Apabila terjadi proses denaturasi maka bagian aktif enzim akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatan reaksinya pun akan menurun.

Kenaikan suhu sebelum terjadinya proses denaturasi dapat menaikan kecepatan reaksi. Koefisien suhu suatu reaksi diartikan sebagai kenaikan kecepatan reaksi sebagai akibat kenaikan suhu 100C. koefisien suhu ini diberi symbol Q10. untuk reaksi yang menggunakan enzim, Q10 ini berkisar antara 1,1 hingga 3,0 artinya setiap kenaikan suhu 100C, kecepatan reaksi mengalami kenaikan 1,1 hinga 3,0 kali. Namun kenaikan suhu pada saat mulai terjadinya proses denaturasi akan mengurangi kecepatan reaksi. Oleh karena ada dua pengaruh yang berlawanan, maka akan terjadi suatu titik optimum, yaitu suhu yang paling tepat bagi suatu reaksi yang menggunakan enzim tertentu.

b)      Perubahan pH, karena dapat mempengaruhi perubahan asam amino kunci apda saat sisi aktif enzim sehingga menghalangi sisi aktif bergabung dengan substratnya. pH enzim optimum berbeda-beda tergantung jenis enzimnya.

c)      Inhibitor enzim, merupakan penghambat kerja enzim. Jika inhibitor ditambahkan ke dalam campuran enzim dan substrat, kecepatan reaksi akan turun. Cara kerja inhibitor ini adalah berikatan dengan enzim membentuk kompleks enzim-inhibitor yang masih mampu atau tidak mampu berikatan dengan substrat. Inhibitor enzim ada dua, yaitu:

§  Inhibitor kompetitif di mana zat pernghambatnya mempunyai struktur yang mirip dengan struktur substrat. Dengan demikian baik substrat maupun zat penghambat berkompetisi atau bersaing untuk bergabung dengan sisia aktif enzim. Jika zat penghambat lebih dulu berikatan dengan sisi aktif enzim, maka substrat tidak bisa lagi berikatan dengan sisi aktif enzim.

§  Inhibitor nonkompetitif di mana substrat sudah tidak dapat berikatan dengan kompleks enzim inhibitor, karena sisia ktif enzim berubah.

d)     Kompleks enzim substrat

Aktivitas enzim tidak meningkat lagi pada konsentrasi substrat tertentu, brown (1902) menduga bahwa enzim di dalam mengikat molekul substrat mempunyai kemampuan terbatas yaitu menjadi jenuh. Michaels mengusulkan suatu persamaan yang didasarkan kepada asumsi sehingga memungkinkan diadakannya pengujian hipotesis. Salah satu asumsinya yaitu

            E     +       S        ↔  ES   →   E   +  P

                   Enzim  +  substrat  ↔  enzim substrat →  enzim  +  produk

Struktur dan mekanisme

Enzim umumnya merupakan protein globular dan ukurannya berkisar dari hanya 62 asam amino pada monomer 4-oksalokrotonat tautomerase, sampai dengan lebih dari 2.500 residu pada asam lemak sintase. Terdapat pula sejumlah kecil katalis RNA, dengan yang paling umum merupakan ribosom; Jenis enzim ini dirujuk sebagai RNA-enzim ataupun ribozim. Aktivitas enzim ditentukan oleh struktur tiga dimensinya (struktur kuaterner). Walaupun struktur enzim menentukan fungsinya, prediksi aktivitas enzim baru yang hanya dilihat dari strukturnya adalah hal yang sangat sulit.

Kebanyakan enzim berukuran lebih besar daripada substratnya, tetapi hanya sebagian kecil asam amino enzim (sekitar 3–4 asam amino) yang secara langsung terlibat dalam katalisis. Daerah yang mengandung residu katalitik yang akan mengikat substrat dan kemudian menjalani reaksi ini dikenal sebagai tapak aktif. Enzim juga dapat mengandung tapak yang mengikat kofaktor yang diperlukan untuk katalisis. Beberapa enzim juga memiliki tapak ikat untuk molekul kecil, yang sering kali merupakan produk langsung ataupun tak langsung dari reaksi yang dikatalisasi. Pengikatan ini dapat meningkatkan ataupun menurunkan aktivitas enzim. Dengan demikian ia berfungsi sebagai regulasi umpan balik.

Sama seperti protein-protein lainnya, enzim merupakan rantai asam amino yang melipat. Tiap-tiap urutan asam amino menghasilkan struktur pelipatan dan sifat-sifat kimiawi yang khas. Rantai protein tunggal kadang-kadang dapat berkumpul bersama dan membentuk kompleks protein. Kebanyakan enzim dapat mengalami denaturasi (yakni terbuka dari lipatannya dan menjadi tidak aktif) oleh pemanasan ataupun denaturan kimiawi. Tergantung pada jenis-jenis enzim, denaturasi dapat bersifat reversibel maupun

ireversibel.

Kespesifikan

Enzim biasanya sangat spesifik terhadap reaksi yang ia kataliskan maupun terhadap substrat yang terlibat dalam reaksi. Bentuk, muatan dan katakteristik hidrofilik/hidrofobik enzim dan substrat bertanggung jawab terhadap kespesifikan ini. Enzim juga dapat menunjukkan tingkat stereospesifisitas, regioselektivitas, dan kemoselektivitas yang sangat tinggi.

Beberapa enzim yang menunjukkan akurasi dan kespesifikan tertinggi terlibat dalam pengkopian dan pengekspresian genom. Enzim-enzim ini memiliki mekanisme "sistem pengecekan ulang". Enzim seperti DNA polimerase mengkatalisasi reaksi pada langkah pertama dan mengecek apakah produk reaksinya benar pada langkah kedua. Proses dwi-langkah ini menurunkan laju kesalahan dengan 1 kesalahan untuk setiap 100 juta reaksi pada polimerase mamalia. Mekanisme yang sama juga dapat ditemukan pada RNA polimerase, aminoasil tRNA sintetase dan ribosom.

Beberapa enzim yang menghasilkan metabolit sekunder dikatakan sebagai "tidak pilih-pilih", yakni bahwa ia dapat bekerja pada berbagai jenis substrat yang berbeda-beda. Diajukan bahwa kespesifikan substrat yang sangat luas ini sangat penting terhadap evolusi lintasan biosintetik yang baru.

Model "kunci dan gembok"

Mekanisme

Enzim dapat bekerja dengan beberapa cara, yang kesemuaannya menurunkan ΔG. Menurunkan energi aktivasi dengan menciptakan suatu lingkungan yang mana keadaan transisi terstabilisasi (contohnya mengubah bentuk substrat menjadi konformasi keadaan transisi ketika ia terikat dengan enzim). Menurunkan energi keadaan transisi tanpa mengubah bentuk substrat dengan menciptakan lingkungan yang memiliki distribusi muatan yang berlawanan dengan keadaan transisi.

Menyediakan lintasan reaksi alternatif. Contohnya bereaksi dengan substrat sementara waktu untuk membentuk kompleks Enzim-Substrat antara. Menurunkan perubahan entropi reaksi dengan menggiring substrat bersama pada orientasi yang tepat untuk bereaksi. Menariknya, efek entropi ini melibatkan destabilisasi keadaan dasar, dan kontribusinya terhadap katalis relatif kecil.

Kofaktor dan koenzim

a.      Kofaktor

Beberapa enzim tidak memerlukan komponen tambahan untuk mencapai aktivitas penuhnya. Namun beberapa pula memerlukan molekul non-protein yang disebut kofaktor untuk berikatan dengan enzim dan menjadi aktif. Kofaktor dapat berupa zat anorganik (contohnya ion logam) ataupun zat organik (contohnya flavin dan heme). Kofaktor organik dapat berupa gugus prostetik yang mengikat dengan kuat, ataupun koenzim, yang akan melepaskan diri dari tapak aktif enzim semasa reaksi. Koenzim mencakup NADH, NADPH dan adenosina trifosfat. Molekul-molekul ini bekerja dengan mentransfer gugus kimiawi antar enzim.

Contoh enzim yang mengandung kofaktor adalah karbonat anhidrase, dengan kofaktor seng terikat sebagai bagian dari tapak aktifnya. Molekul yang terikat dengan kuat ini biasanya ditemukan pada tapak aktif dan terlibat dalam katalisis.

Enzim yang memerlukan kofaktor namun tidak terdapat kofaktor yang terikat dengannya disebut sebagai aproenzim ataupun apoprotein. Apoenzim beserta dengan kofaktornya disebut holoenzim (bentuk aktif). Kebanyakan kofaktor tidak terikat secara kovalen dengan enzim, tetapi terikat dengan kuat. Namun, gugus prostetik organik dapat pula terikat secara kovalen (contohnya tiamina pirofosfat pada enzim piruvat dehidrogenase). Istilah holoenzim juga dapat digunakan untuk merujuk pada enzim yang mengandung subunit protein berganda, seperti DNA polimerase. Pada kasus ini, holoenzim adalah kompleks lengkap yang mengandung seluruh subunit yang diperlukan agar menjadi aktif.

b.      Koenzim

Model pengisian ruang koenzim NADH

Koenzim adalah molekul organik kecil yang mengantarkan gugus kimia dari satu enzim ke enzim lainnya. Beberapa koenzim seperti riboflavin, tiamina, dan asam folat adalah vitamin. Gugus kimiawi yang dibawa mencakup ion hidrida (H-) yang dibawa oleh NAD atau NADP+, gugus asetil yang dibawa oleh koenzim A, formil, metenil, ataupun gugus metil yang dibawa oleh asam folat, dan gugus metil yang dibawa oleh S-adenosilmetionina.

Oleh karena koenzim secara kimiawi berubah oleh aksi enzim, adalah dapat dikatakan koenzim merupakan substrat yang khusus, ataupun substrat sekunder. Sebagai contoh, sekitar 700 enzim diketahui menggunakan koenzim NADH. Regenerasi serta pemeliharaan konsentrasi koenzim terjadi dalam sel. NADPH diregenerasi melalui lintasan pentosa fosfat, dan S-adenosilmetionina melalui metionina adenosiltransferase.

PEMIARAAN (KULTUR) BAKTERI

Untuk menggampangkan pemeriksaan perlulah diadakan pemiaraan atau biakan bakteri, sehingga sewaktu-waktu perlu, bakteri itu selalu tersedia. Piaraan dapat disimpan di dalam almari es untuk waktu yang lama.

1. PIARAAN CAMPURAN, PIARAAN MURNI

Supaya kita mendapatkan satu spesies saja dalam satu piaraan, maka perlulah diadakan suatu piaraan murni (pure culture). Piaraan murni dapat diperoleh dari piaraan campuran (mixed culture) dengan cara sebagai berikut.

Kalau kita pertama kali mengadakan piaraan, biasanya yang kita peroleh itu suatu piaraan campuran. Misal, kita ambil bahan (sampel) dari udara, dari tanah, dari kotoran; kalau bahan itu kita sebarkan pada medium steril, akan tumbuhlah beraneka koloni yang masing-masing mempunyi sifat-sifat yang khas. Jika kita mengambil bahan dari salah satu koloni tersebut, kemudian bahan itu kita tanam pada medium baru yang steril, maka bahan itu akan tumbuh menjadi koloni yang murni, asalkan pekerjaan pemindahan itu dilakukan dengan cermat menurut teknik aseptik, yaitu menggunakan alat-alat yang steril dan aturan-aturan laboratorium tertentu. Piaraan yang kita peroleh dengan jalan demikian kita sebut piaraan pertama (primary culture), dan sifatnya murni. Piaraan semacam ini dapat disimpan, tetapi tiap-tiap waktu tertentu harus diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium baru. Piaraan-piaraan yang diperoleh dari piaraan pertama disebut piaraan turunan (sub-culture).

Tiap-tiap laboratorium perlu menyimpan beberapa jenis piaraan murni. Negara-negara yang sudah maju mesti mempunyai koleksi pelbagai piaraan murni; piaraan simpanan itu disebut juga “stock culture”.

Ada piaraan species bakteri yang sewaktu-waktu, yaitu tiap 2 atau 3 bulan sekali, perlu diremajakan, meskipun piaraan itu selalu disimpan di dalam almari es. Untuk meremajakan piaraan itu caranya sama dengan yang telah diceritakan di atas yaitu dengan memindahkan “bibit” dari koloni yang lama kepada medium yang baru. Setelah tanaman baru itu dibiarkan tumbuh beberapa jam dalam temperatur biasa (25^o – 27^o C), koloni baru ini dimasukkan dalam almari es, untuk diperbaharui 2 atau 3 bulan lagi.

Cara lain untuk menyimpan piaraan murni ialah dengan jalan liofilisasi yang prosedurnya sebagai berikut. Bakteri ditanam didalam air susu yang tidak mengandung lemak atau di dalam serum yang steril. Setelah tumbuh, diambillah 0,1 ml dari medium tersebut untuk dimasukkan ke dalam botol-botol kecil (ampul) yang dari dalam telah dilapisi dengan alkohol yang mengandung CO₂ yang kental (temperatur -78^oC). Kemudian leher botol itu dipijarkan sehingga tertutuplah botol berisi bakteri itu. Dalam keadaan demikian ini bakteri dapat disimpan sampai bertahun-tahun, asal selalu ada dalam 4^oC.

2. DASAR MAKANAN (MEDIUM ATAU SUBSTRAT)

Berupa apakah makanan bakteri itu? Dasar makanan yang paling baik bagi pemiaraan bakteri ialah medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa makanan, atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia. Medium yang banyak digunakan dalam pekerjaan rutin di laboratorium ialah kaldu cair dan kaldu agar. Medium ini tersusun daripada:

Kaldu bubuk 3 g

Pepton 5 g

Air suling 1000 g

Jika diperlukan medium padat, maka kepadanya ditambahkan 15 g agar-agar. Medium ini disebut medium baku. Untuk keperluan penelitian yang berhubungan dengan serologi perlu ditambahkan 5 g NaCl.

Jika tidak ada kaldu bubuk, bahan itu dapat diganti dengan rebusan daging yang diperoleh sebagai berikut: Ambil barang 0,5 kg daging yang tidak berlemak, rendam dalam 1.000 ml air suling semalam-malaman dalam almari es. Paginya buanglah lemak yang mungkin terdapat mengapung di permukaan air. Kemudian peraslah suspensi lewat kain mori yang halus. Tambahkan air suling kepada filtrat sehingga volume menjadi 1 liter lagi. Kepada medium ini ditambahkan 5 g pepton dan lain-lainnya yang diperlukan, lalu panasi suspensi sampai 100^oC selama 20 menit. Akhirnya tuangkanlah suspensi lewat kertas saring, dan tambahkan air suling lagi sehingga volume tetap 1 liter. Medium ini perlu disterilkan dahulu sebelum digunakan untuk memiara bakteri. Juga keasaman medium perlu diatur, biasanya pH 7.

Untuk mengetahui jenis-jenis medium yang lain, yang berkepentingan dipersilakan membaca buku-buku praktikum mikrobiologi atau bakteriologi.

Selanjutnya medium buatan manusia itu dapat berupa:

A. MEDIUM CAIR

Medium cair yang dipakai ialah kaldu yang disiapkan sebagai berikut. Kepada 1 liter air murni ditambahkan 3 g kaldu daging lembu dan 5 g pepton. Pepton ialah protein yang terdapat pada daging, pada air susu, pada kedelai, dan pada putih telur. Pepton mengandung banyak N₂, sedang kaldu berisi garam-garam mineral dan lain-lainnya lagi. Medium itu kemudian ditentukan pHnya 6,8 sampai 7, jadi sedikit asam atau netral; keadaan yang demikian ini sesuai bagi kebanyakan bakteri. Kaldu seperti tersebut di atas masih perlu disaring untuk kemudian dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksi atau botol-botol. Penyaringan dapat dilakukan dengan kertas saring. Setelah tabung atau botol berisi medium kaldu tersebut disumbat dengan kapas, dapatlah mereka dimasukkan ke dalam alat pensteril (autoklaf).

B. MEDIUM KENTAL (PADAT)

Dahulu kala orang lazim menggunakan kentang yang di potong-potong serupa silinder untuk medium. Silinder kentang mentah dibuat dengan pipa besi, lalu potongan-potongan itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian tabung disumbat dengan kapas, dan setelah itu disterilkan di dalam autoklaf. Setelah kentang dingin kembali, permukaan atas dari silinder kentang dapat ditanami bakteri.

Suatu penemuan yang baik sekali ialah medium dari kaldu yang dicampur dengan sedikit agar-agar. Setelah medium itu disterilisasikan, dan kemudian dibiarkan mendingin, maka kita perolehlah medium padat. Gelatin dapat juga dipakai sebagai bahan pengental – dan memang dahulu orang biasa memakainya – tetapi sejak lama orang lebih suka menggunakan agar-agar. Agar-agar baru mencair pada suhu 95^oC, sedangkan gelatin sudah mencair pada suhu 23^o C. Dengan demikian medium yang mengandung gelatin perlu disimpan dalam tempat yang lebih dingin daripada temperatur kamar, jika dikehendaki medium tersebut tetap dalam keadaan padat.

Agar-agar ialah sekedar zat pengentai, dan bukan zat makanan bagi bakteri. Gelatin sebaliknya dapat diencerkan oleh enzim-enzim bakteri. Gelatin diperoleh dari rebusan tulang-tulang, jadi gelatin itu zat serupa perekat.

C. MEDIUM YANG DIPERKAYA

Kebanyakan bakteri suka tumbuh pada dasar makanan seperti disebut di atas. Tetapi bakteri patogen seperti Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis, Diplococus pneumoniae, dan Neisseria gonnorhoeae memerlukan zat makanan tambahan berupa serum atau darah yang tak mengandung fibrinogen lagi. Fibrinogen adalah zat yang menyebabkan darah menjadi kental, apabila keluar di luka. Serum atau darah itu dicampurkan ke dalam medium yang sudah disterilkan. Jika pencampuran ini dilakukan sebelum sterilisasi, maka serum atau darah tersebut akan mengental akibat pemanasan. Pada medium buatan Loeffler, serum dicampurkan di dalam dasar makanan sebelum sterilisasi. Medium ini baik sekali untuk memiara basil-basil dipteri. Juga medium yang memerlukan tambahan putih telur dibuat dengan cara demikian. Sering kali orang menambahkan susu atau air tomat kepada dasar makanan untuk menumbuhkan Lactobacillus dan beberapa spesies lainnya.

D. MEDIUM YANG KERING

Pekerjaan laboratorium sekarang ini banyak dipermudah dengan telah adanya bermacam-macam medium yang tersedia dalam bentuk serbuk kering. Untuk menyiapkan medium tersebut, cukuplah orang mengambil sekian gram serbuk kering tersebut untuk dilarutkan dalam sekian gram serbuk kering tersebut untuk dilarutkan dalam sekian liter air dan kemudian larutan itu disterilkan. Penentuan pH tidak perlu lagi, karena hal itu sudah dilakukan lebih dulu pada pembuatan serbuk. Periksalah “Difco Manual of dehydrated culture media and reagents for microbiological and clinical laboratory procedures”.

E. MEDIUM YANG SINTETIK

Medium sintetik berupa ramuan-ramuan zat anorganik yang tertentu yang mengandung zat karbon dan nitrogen. Bakteri autotrof dapat hidup dalam medium ini. Bakteri saprofit (istilah lain untuk ini ialah saprobakteri) dapat juga dipiara di dalam medium ini asalkan kepada medium ini ditambahkan natrium sitrat dan natrium amonium fosfat; yang pertama merupakan sumber karbon, sedang yang kedua merupakan sumber nitrogen. Medium ini buatan Koser, dan medium ini berguna untuk membedakan Aerobacter aerogenes dari Escherichia coli; yang pertama dapat hidup dalam medium ini, sedang yang kedua tidak. Medium yang hanya cocok untuk spesies-spesies tertentu, dan tidak cocok untuk spesies-spesies yang lain, itu disebut medium selektif.

Medium sintetik itu umumnya dibuat secara eksperimental. Medium ini tidak menimbulkan zat-zat penolak, apabila masuk tubuh hewan atau manusia. Selanjutnya medium sintetik itu berguna sekali sebagai medium dasar dalam penyelidikan macam-macam vitamin, asam amino dan lain-lain. Penyelidikan macam-macam vitamin, asam amino dan lain-lain. Penyelidikan tentang ada tidaknya zat-zat tertentu dengan menggunakan mikroorganisme itu disebut analisis zat jadi atau bio-assay.

PEMIARAAN (KULTUR) BAKTERI

Untuk menggampangkan pemeriksaan perlulah diadakan pemiaraan atau biakan bakteri, sehingga sewaktu-waktu perlu, bakteri itu selalu tersedia. Piaraan dapat disimpan di dalam almari es untuk waktu yang lama.

1. PIARAAN CAMPURAN, PIARAAN MURNI

Supaya kita mendapatkan satu spesies saja dalam satu piaraan, maka perlulah diadakan suatu piaraan murni (pure culture). Piaraan murni dapat diperoleh dari piaraan campuran (mixed culture) dengan cara sebagai berikut.

Kalau kita pertama kali mengadakan piaraan, biasanya yang kita peroleh itu suatu piaraan campuran. Misal, kita ambil bahan (sampel) dari udara, dari tanah, dari kotoran; kalau bahan itu kita sebarkan pada medium steril, akan tumbuhlah beraneka koloni yang masing-masing mempunyi sifat-sifat yang khas. Jika kita mengambil bahan dari salah satu koloni tersebut, kemudian bahan itu kita tanam pada medium baru yang steril, maka bahan itu akan tumbuh menjadi koloni yang murni, asalkan pekerjaan pemindahan itu dilakukan dengan cermat menurut teknik aseptik, yaitu menggunakan alat-alat yang steril dan aturan-aturan laboratorium tertentu. Piaraan yang kita peroleh dengan jalan demikian kita sebut piaraan pertama (primary culture), dan sifatnya murni. Piaraan semacam ini dapat disimpan, tetapi tiap-tiap waktu tertentu harus diadakan peremajaan dengan memindahkannya ke medium baru. Piaraan-piaraan yang diperoleh dari piaraan pertama disebut piaraan turunan (sub-culture).

Tiap-tiap laboratorium perlu menyimpan beberapa jenis piaraan murni. Negara-negara yang sudah maju mesti mempunyai koleksi pelbagai piaraan murni; piaraan simpanan itu disebut juga “stock culture”.

Ada piaraan species bakteri yang sewaktu-waktu, yaitu tiap 2 atau 3 bulan sekali, perlu diremajakan, meskipun piaraan itu selalu disimpan di dalam almari es. Untuk meremajakan piaraan itu caranya sama dengan yang telah diceritakan di atas yaitu dengan memindahkan “bibit” dari koloni yang lama kepada medium yang baru. Setelah tanaman baru itu dibiarkan tumbuh beberapa jam dalam temperatur biasa (25^o – 27^o C), koloni baru ini dimasukkan dalam almari es, untuk diperbaharui 2 atau 3 bulan lagi.

Cara lain untuk menyimpan piaraan murni ialah dengan jalan liofilisasi yang prosedurnya sebagai berikut. Bakteri ditanam didalam air susu yang tidak mengandung lemak atau di dalam serum yang steril. Setelah tumbuh, diambillah 0,1 ml dari medium tersebut untuk dimasukkan ke dalam botol-botol kecil (ampul) yang dari dalam telah dilapisi dengan alkohol yang mengandung CO₂ yang kental (temperatur -78^oC). Kemudian leher botol itu dipijarkan sehingga tertutuplah botol berisi bakteri itu. Dalam keadaan demikian ini bakteri dapat disimpan sampai bertahun-tahun, asal selalu ada dalam 4^oC.

2. DASAR MAKANAN (MEDIUM ATAU SUBSTRAT)

Berupa apakah makanan bakteri itu? Dasar makanan yang paling baik bagi pemiaraan bakteri ialah medium yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa makanan, atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia. Medium yang banyak digunakan dalam pekerjaan rutin di laboratorium ialah kaldu cair dan kaldu agar. Medium ini tersusun daripada:

Kaldu bubuk 3 g

Pepton 5 g

Air suling 1000 g

Jika diperlukan medium padat, maka kepadanya ditambahkan 15 g agar-agar. Medium ini disebut medium baku. Untuk keperluan penelitian yang berhubungan dengan serologi perlu ditambahkan 5 g NaCl.

Jika tidak ada kaldu bubuk, bahan itu dapat diganti dengan rebusan daging yang diperoleh sebagai berikut: Ambil barang 0,5 kg daging yang tidak berlemak, rendam dalam 1.000 ml air suling semalam-malaman dalam almari es. Paginya buanglah lemak yang mungkin terdapat mengapung di permukaan air. Kemudian peraslah suspensi lewat kain mori yang halus. Tambahkan air suling kepada filtrat sehingga volume menjadi 1 liter lagi. Kepada medium ini ditambahkan 5 g pepton dan lain-lainnya yang diperlukan, lalu panasi suspensi sampai 100^oC selama 20 menit. Akhirnya tuangkanlah suspensi lewat kertas saring, dan tambahkan air suling lagi sehingga volume tetap 1 liter. Medium ini perlu disterilkan dahulu sebelum digunakan untuk memiara bakteri. Juga keasaman medium perlu diatur, biasanya pH 7.

Untuk mengetahui jenis-jenis medium yang lain, yang berkepentingan dipersilakan membaca buku-buku praktikum mikrobiologi atau bakteriologi.

Selanjutnya medium buatan manusia itu dapat berupa:

A. MEDIUM CAIR

Medium cair yang dipakai ialah kaldu yang disiapkan sebagai berikut. Kepada 1 liter air murni ditambahkan 3 g kaldu daging lembu dan 5 g pepton. Pepton ialah protein yang terdapat pada daging, pada air susu, pada kedelai, dan pada putih telur. Pepton mengandung banyak N₂, sedang kaldu berisi garam-garam mineral dan lain-lainnya lagi. Medium itu kemudian ditentukan pHnya 6,8 sampai 7, jadi sedikit asam atau netral; keadaan yang demikian ini sesuai bagi kebanyakan bakteri. Kaldu seperti tersebut di atas masih perlu disaring untuk kemudian dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksi atau botol-botol. Penyaringan dapat dilakukan dengan kertas saring. Setelah tabung atau botol berisi medium kaldu tersebut disumbat dengan kapas, dapatlah mereka dimasukkan ke dalam alat pensteril (autoklaf).

B. MEDIUM KENTAL (PADAT)

Dahulu kala orang lazim menggunakan kentang yang di potong-potong serupa silinder untuk medium. Silinder kentang mentah dibuat dengan pipa besi, lalu potongan-potongan itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian tabung disumbat dengan kapas, dan setelah itu disterilkan di dalam autoklaf. Setelah kentang dingin kembali, permukaan atas dari silinder kentang dapat ditanami bakteri.

Suatu penemuan yang baik sekali ialah medium dari kaldu yang dicampur dengan sedikit agar-agar. Setelah medium itu disterilisasikan, dan kemudian dibiarkan mendingin, maka kita perolehlah medium padat. Gelatin dapat juga dipakai sebagai bahan pengental – dan memang dahulu orang biasa memakainya – tetapi sejak lama orang lebih suka menggunakan agar-agar. Agar-agar baru mencair pada suhu 95^oC, sedangkan gelatin sudah mencair pada suhu 23^o C. Dengan demikian medium yang mengandung gelatin perlu disimpan dalam tempat yang lebih dingin daripada temperatur kamar, jika dikehendaki medium tersebut tetap dalam keadaan padat.

Agar-agar ialah sekedar zat pengentai, dan bukan zat makanan bagi bakteri. Gelatin sebaliknya dapat diencerkan oleh enzim-enzim bakteri. Gelatin diperoleh dari rebusan tulang-tulang, jadi gelatin itu zat serupa perekat.

C. MEDIUM YANG DIPERKAYA

Kebanyakan bakteri suka tumbuh pada dasar makanan seperti disebut di atas. Tetapi bakteri patogen seperti Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis, Diplococus pneumoniae, dan Neisseria gonnorhoeae memerlukan zat makanan tambahan berupa serum atau darah yang tak mengandung fibrinogen lagi. Fibrinogen adalah zat yang menyebabkan darah menjadi kental, apabila keluar di luka. Serum atau darah itu dicampurkan ke dalam medium yang sudah disterilkan. Jika pencampuran ini dilakukan sebelum sterilisasi, maka serum atau darah tersebut akan mengental akibat pemanasan. Pada medium buatan Loeffler, serum dicampurkan di dalam dasar makanan sebelum sterilisasi. Medium ini baik sekali untuk memiara basil-basil dipteri. Juga medium yang memerlukan tambahan putih telur dibuat dengan cara demikian. Sering kali orang menambahkan susu atau air tomat kepada dasar makanan untuk menumbuhkan Lactobacillus dan beberapa spesies lainnya.

D. MEDIUM YANG KERING

Pekerjaan laboratorium sekarang ini banyak dipermudah dengan telah adanya bermacam-macam medium yang tersedia dalam bentuk serbuk kering. Untuk menyiapkan medium tersebut, cukuplah orang mengambil sekian gram serbuk kering tersebut untuk dilarutkan dalam sekian gram serbuk kering tersebut untuk dilarutkan dalam sekian liter air dan kemudian larutan itu disterilkan. Penentuan pH tidak perlu lagi, karena hal itu sudah dilakukan lebih dulu pada pembuatan serbuk. Periksalah “Difco Manual of dehydrated culture media and reagents for microbiological and clinical laboratory procedures”.

E. MEDIUM YANG SINTETIK

Medium sintetik berupa ramuan-ramuan zat anorganik yang tertentu yang mengandung zat karbon dan nitrogen. Bakteri autotrof dapat hidup dalam medium ini. Bakteri saprofit (istilah lain untuk ini ialah saprobakteri) dapat juga dipiara di dalam medium ini asalkan kepada medium ini ditambahkan natrium sitrat dan natrium amonium fosfat; yang pertama merupakan sumber karbon, sedang yang kedua merupakan sumber nitrogen. Medium ini buatan Koser, dan medium ini berguna untuk membedakan Aerobacter aerogenes dari Escherichia coli; yang pertama dapat hidup dalam medium ini, sedang yang kedua tidak. Medium yang hanya cocok untuk spesies-spesies tertentu, dan tidak cocok untuk spesies-spesies yang lain, itu disebut medium selektif.

Medium sintetik itu umumnya dibuat secara eksperimental. Medium ini tidak menimbulkan zat-zat penolak, apabila masuk tubuh hewan atau manusia. Selanjutnya medium sintetik itu berguna sekali sebagai medium dasar dalam penyelidikan macam-macam vitamin, asam amino dan lain-lain. Penyelidikan macam-macam vitamin, asam amino dan lain-lain. Penyelidikan tentang ada tidaknya zat-zat tertentu dengan menggunakan mikroorganisme itu disebut analisis zat jadi atau bio-assay.

TEKNIK PEWARNAAN MIKROORGANISME

 A. PENDAHULUAN

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa
Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain.
Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan nukleus.
Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut:
mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai.
mempersiapkan apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis.
Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.
Biakan Cair. Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan mengering diudaraata diatas api kecil dengan jarak 25 cm. Biakan Padat. Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering diudara.• Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api.
B. DASAR TEORI
-pewarnaan gram
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.
Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).
Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).
Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.
- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :
- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.
- Fiksasi olesan pada kaca objek.
- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial.
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :
- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).
Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).
Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005).
Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri (Anonim, 2008):


Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008):
a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.
Pewarnaan Endospora. Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas (Irawan, 2008).
Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan, 2008):

Mikrobiologi

ISOLASI DAN PEMBIAKAN MIKROBA

DASAR TEORI

Untuk memperhatikan hasil isolasi mikroorganisme yang diinginkan dari habitatnya, hal-hal yang perlu diperhatikan menurut (Sastrahidayat, 1994):

·         Keadaan bahan penyakit

·         Sebelum diisolasi dilakukan disinfetasi permukaan untuk mengurangi kontaminasi. Beberapa bahan yang digunakan adalah HgCl2, C4ClO, dan AgNO3.

·         Suhu yang di gunakan selama inkubasi harus diperhatikan

·         Medium yang digunakan

Ruang tempat inokulasi itu kecil, bersih dan bebas dingin. Pada waktu melaksanakan inokulasi, meja tempat inokulasi didasari dengan kain basah. Pemindahan dengan kawat inokulasi dari pltina atau dai nikrom, ujung boleh lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3 mm. setelah pengambilan inokulasi selesai, mulut tabung dipanasi kemudian disumbat kemudian digesekan pada medium baru atau pada suatu kaca benda, tujuannya membuat suatu sediaan. Medium diletakan terbalik untuk menghindari tetesnya air yang melekat pada dinding dalam tutup cawan, sehingga bakteri yang diinokulasikan dapat dapat menyebar luas ke seluruh permukaan medium. Bakteri yang aerob maupun anaerob dapat tumbuh dan banyaknya koloni mudah dihitung.

Pembiakan mikroba juga dapat dilakukan dengan pengenceran yaitu macam species diencerkan dalam satu tabung tersendiri kemudian diambil untuk diencerkan lagi, dari enceran kedua diambil untuk diencerkan lebih lanjut. Selanjutnya disebarkan pada medium padat, dan akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium (Dwijoseputro, 1998).

SIFAT-SIFAT SEL KAPANG

Kapang adalah sejenis jamur dimana sangat membantu sekali pada proses pembuatan tempe. Kapang yang digunakan adalah kapang jenis rhizopus. Pada kapang tidak dijumpai adanya hifa dan spora (anonymous, 2004).

Kapang ada yang mempunyai sifat mikoparasit, yaitu kemampuan untuk parasit bagi kapang lain. Sifat ini dimanfaatkan sebagai agen biokantral terhadap jenis-jenis kapang fitoplatogen, kapang ini bernama trichoderma harzianam (Diliello, 2002).

Kapang sangat membantu dalam proses pembuatan tempe, kapang yang digunakan antar lain Rhizopus Oligisporius, Rhizopus Arrhizus dan Rhizopus stolonifer. Kapang dalam tempe mampu mencerna matriks antara sel-sel biji kedelai. Sementara enzim yang dihasilkan kapang selama fermentasi menimbulkan perubahan pada protein, lemak, dan karbohidrat (Stanier,2001).

Semua kapang bersifat aerobic yaitu membutuhkan oksigen untuk pertumbuhannya. Kapang tumbuh pada kisaran pH 2-8,5 tapi pertumbuhannya akan lebih baik pada asam atau pH rendah. Kapang memproduksi enzim hidrolik. Misalnya amylase, pektinase, proteinase, dan lipase. Oleh karena itu, dapat tumbuh pada makanan-makanan yang mengandung pati, pectin, protein dan lipid. Kapang mengeluarkan kamponen yang dapat menghambat organisme lainnya. Komponen ini disebut antibiotic misalnya penisilin yang diproduksi oleh penicillium chrysagenum dan clavosin yang diproduksi oleh Aspergillus Clavatus ( Fardias, 1992).

KUANTITASI MIKROORGANISME

DASAR TEORI

Pada saat perhitungan koloni, apabila jumlah koloni yang di temukan pada lempengan kurang dari standart yang telah di tetapkan, maka suatu sample bisa di katakana murni.(Dilliello, 2002)

Terkadang untuk menghitung kuantitas mikroorganisme pada sample dapat di uji dengan cara menghitung jumlah koloni pada agar. Agar lempengan yang telah ditetapkan, disingkat jumlah penjumlahan pada lempengan (Standart plate count). (Dwisaputro, 2002)

Standart plate count (perhitunngan jumlah pada lempengan) sangat berguna dalam hal mengetahui kuantitas mikroorganisme pada suatu tempat atau sampel sehingga bisa di ketahui apakah sampel tersebut murni atau tidak murni. (Stanier, 2001)

Perhitungan koloni:

Pour plate : 1 × ∑ koloni

Faktor pengencer

Spread plate : 1 × 10 × ∑ koloni

Faktor pengencer

Standart plate count : 30 – 300 koloni

Syarat :

·         Jika kurang dari 2 : Dipakai pengencer terbesar

·         Jika lebih dari 2 : Dipakai rata-rata

Perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara decimal. Semakin tinggi jumlah mikroba yang terdapat di dalam sample, semakin tinggi pengenceran yang harus dilakukan. (Fardius, 1992)

Untuk melaporkan suatu hasil analisis mikrobiologi digunakan suatu standart yang disebut “Standart Plate Count (SPC)” menjelaskan mengenai cara menghitung koloni pada cawan serta memilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni. Cara menghitung jumlah koloni pada cawan adalah sebagai berikut (Fardius, 1992):

·         Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 – 300

·         Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloni diragukan, dapat dihitung sebagai koloni.

·         Suatu deretan (rantai) yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.

Data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angaka pertama di depan koma dan angka ke dua dibelakang koma. Jika semua pengenceran menghasilkan angka kurang dari 30 koloni, hanya jumlah koloni yang terendah yang dihitung. Jika semua pengenceran menghasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan Petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. (Fardius, 1992)

Mikrobiologi

MEDIA PEMBIAKAN

Media berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba, dimana dalam proses pembuatannya harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media. Berikut ini beberapa media yang sering digunakan secara umum dalam mikrobiologi.

Lactose Broth
Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth) untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk koliform.
Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.

EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)
Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli.
Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan metilin bklue sebagai indikator memberikan perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri koli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat), tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air.

Nutrient Agar
Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni.
Untuk komposisi nutrien adar adalah eksrak beef 10 g, pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 g agar/L. Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit. Kemudian siapkan wadah sesuai yang dibutuhkan.

Nutrient Broth
Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Nutrient broth dibuat dengan cara sebagai berikut.
1.Larutkan 5 g pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades.
2.Larutkan 3 g ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama.
3.Atur pH sampai 7,0.
4.Beri air distilasi sebanyak 1.000 ml.
5.Sterilisasi dengan autoklaf.

MRSA (deMann Rogosa Sharpe Agar)

MRSA merupakan media yang diperkenalkan oleh De Mann, Rogosa, dan Shape (1960) untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengandung polysorbat, asetat, magnesium, dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai faktor pertumbuhan bagi Lactobacillus, sebaik nutrien diperkaya MRS agar tidak sangat selektif, sehingga ada kemungkinan Pediococcus dan jenis Leuconostoc serta jenis bakteri lain dapat tumbuh. MRS agar mengandung:
1.Protein dari kasein 10 g/L
2.Ekstrak daging 8,0 g/L
3.Ekstrak ragi 4,0 g/L
4.D (+) glukosa 20 g/L
5.Magnesium sulfat 0,2 g/L
6.Agar-agar 14 g/L
7.dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L
8.Tween 80 1,0 g/L
9.Diamonium hidrogen sitrat 2 g/L
10.Natrium asetat 5 g/L
11.Mangan sulfat 0,04 g/L

MRSB merupakan media yang serupa dengan MRSA yang berbentuk cair/broth.
Dari enidchemicals.com

Trypticase Soy Broth (TSB)
TSB adalah media broth diperkaya untuk tujuan umum, untuk isolasi, dan penumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunakan untuk isolasi bakteri dari spesimen laboratorium dan akan mendukung pertumbuhan mayoritas bakteri patogen.
Media TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikroorganisme. Dekstrosa adalah sumber energi dan natrium klorida mempertahankan kesetimbangan osmotik. Dikalium fosfat ditambahkan sebagai buffer untuk mempertahankan pH.

Plate Count Agar (PCA)
PCA digunakan sebagai medium untuk mikroba aerobik dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzymic hydrolisate, yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspensi 22,5 g/L kemudian disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 121°C). Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total mikroba (semua jenis mikroba) karena di dalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi nitrogen komplek lainnya serta ekstrak yeast mensuplai vitamin B kompleks.

APDA
Media APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitung jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suatu sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai. Adanya asam tartarat dan pH rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1 jam/45 menit, agar dilelehkan dalam 500 ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam agar lalu ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat.

Potato Dextrose Agar (PDA)
PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang. Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 g media dalam 1 liter air yang telah didestilasi. campur dan panaskan serta aduk. Didihkan selama 1 menit untuk melarutkan media secara sempurna. Sterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit. Dinginkan hingga suhu 40-45°C dan tuang dalam cawan petri dengan pH akhir 5,6+0,2.

VRBA (Violet Red Bile Agar)
VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet kristal yang bersifat basa, sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati. Dengan VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan-bahan yang dibutuhkan untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton, NaCl, empedu, glukosa, neutral red, kristal violet, agar). Bahan-bahan tersebut kemudian dicampur dengan 1 liter air yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih sampai larut sempurna. Dinginkan hingga 50-60°C. Pindahkan dalam tabung sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4. Campuran garam bile dan kristal violet menghambat bakteri gram positif. Yeast ekstrak menyediakan vitamin B-kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri. Laktosa merupakan sumber karbohidrat. Neutral red sebagai indikator pH. Agar merupakan agen pemadat.

PGYA
Media ini berfungsi untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir. Dengan adanya dekstrosa yang terkandung dalam media ini, PGYA dapat digunakan untuk mengidentifikasi mikroba terutama sel khamir. Untuk membuatnya, semua bahan dicampur dengan ditambah CaCO3 terlebih dahulu sebanyak 0,5 g lalu dilarutkan dengan akuades. Kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer dan disumbat dengan kapas lalu disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit.

STERILISASI ALAT DAN BAHAN

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992). Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi. Jika sterilisasi berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk paling resisten dari kehidupan mikrobia akan diluluhkan (Lay dan Hastowo, 1992).

Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu panas, penyaringan, radiasi, dan penambahan bahan kimia. Sedangkan sterilisasi dengan cara panas dapat dilakukan dengan panas basah, panas kering, pemanasan bertahap dan perebusan.

Pemanasan basah

Pemanasan basah adalah sterilisasi panas yang digunakan bersama-sama dengan uap air. Pemanasan basah biasanya dilakukan didalam autoklaf atau aterilisator uap yang mudah diangkat dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan pada suhu 121⁰C selama 15 menit (Hadioetomo, 1985). Cara pemanasan basah dapat membunuh jasad renik atau mikroorganisme terutama karena panas basah dapat menyebabkan denaturasi protein, termasuk enzim-enzim didalam sel (Fardiaz, 1992).

Pemanasan kering

Dibandingkan pemanasan basah, pemanasan kering kurang efisien dan membutuhkan suhu yang lebih tinggi serta waktu lama untuk sterilisasi. Hal ini disebabkan karena tanpa kelembaban maka tidak ada panas laten (Hadioetomo, 1985). Pemanasan kering dapat menyebabkan dehidrasi sel dan oksidasi komponen-komponen di dalam sel (Fardiaz, 1992). Keuntungan dari pemanasan kering adalah tidak adanya uap air yang membasahi bahan atau alat yang disterilkan, selain itu peralatan yang digunakan untuk sterilisasi uap kering lebih murah dibandingkan uap basah (Lay dan Hastowo, 1992). Pemanasan kering sering dilakukan dalam sterilisasi alat-alat gelas di laboratorium, dimana menggunakan oven dengan suhu 160-180⁰C selama 1,5-2 jam dengan sistem udara statis (Fardiaz, 1992).

Pemanasan bertahap

Pemanasan bertahap dilakukan bila media atau bahan kimia tahan terhadap uap 100⁰C (Lay dan Hastowo, 1992). Pemanasan bertahap (tindalisasi) dilakukan dengan cara memanaskan medium atau larutan menggunakan uap selama satu jam setiap hari untuk tiga hari berturut-turut. Waktu inkubasi diantara dua proses pemanasan sengaja diadakan supaya spora dapat bergerminasi menjadi sel vegetatif sehingga mudah dibunuh pada pemanasan berikutnya (Fardiaz, 1992).

Perebusan

Perebusan adalah pemanasan didalam air mendidih atau uap air pada suhu 100⁰C selama beberapa menit (Fardiaz,1992). Pada suhu ini sel vegetatif dimatikan, sedang spora belum dapat dihilangkan (Lay dan Hastowo, 1992).

Beberapa bakteri tertentu tahan terhadap suhu perebusan ini, misalnya Clostridium perfringens dan Clostridium botulinum tetap hidup meskipun direbus selama beberapa jam (Lay dan Hastowo, 1992)

Penyaringan

Penyaringan adalah proses sterilisasi yang dilakukan pada suhu kamar. Sterilisasi dengan penyaringan digunakan untuk bahan yang peka terhadap panas misalnya serum, urea dan enzim (Lay dan hastowo, 1992). Dengan cara penyaringan larutan atau suspensi dibebaskan dari semua organisme hidup dengan cara melakukannya lewat saringan dengan ukuran pori yang sedemikian kecilnya sehingga bakteri dan sel-sel yang lebih besar tertahan diatasnya, sedangkan filtratnya ditampung didalam wadah yang steril (Hadioetomo,1985).

Radiasi ionisasi

Radiasi ionisasi adalah radiasi yang mengandung energi yang jauh lebih tinggi daripada sinar ultraviolet. Oleh karena itu mempunyai daya desinfektan yang lebih kuat. Salah satu contoh radiasi ionisasi adalah sinar gamma yang dipancarkan dari kobalt-10 (Fardiaz, 1992). Radiasi dengan sinar gama dapat menyebabkan ion bersifat hiperaktif (Lay dan Hastowo, 1992).

Radiasi sinar ultra violet

Sinar ultra violet dengan panjang gelombang yang pendek memiliki daya antimikrobial yang sangat kuat. Daya kerjanya adalah absorbsi oleh asam nukleat tanpa menyebabkan kerusakan pada permukaan sel. Kerusakan tersebut dapat diperbaiki bila disinari dengan berkas yang mempunyai gelombang yang lebih panjang (Lay dan Hastowo, 1992).

Penambahan bahan kimia

Menurut Lay dan Hastowo (1992), bahan yang menjadi rusak bila disterilkan pada suhu yang tinggi dapat disterilkan secara kimiawi dengan menggunakan gas. Bahan kimia yang sering digunakan antara lain : 1) Alkohol, daya kerjanya adalah mengkoagulasi protein. Cairan alkohol yang umum digunakan berkonsentrasi 70-80 % karena konsentrasi yang lebih tinggi atau lebih rendah kurang efektif. 2) Khlor, Gas khlor dengan air akan menghasilkan ion hipokloride yang akan mengkoagulasikan protein sehingga membran sel rusak dan terjadi inaktivasi enzim. 3) Yodium, daya kerjanya adalah bereaksi dengan tyrosin, suatu asam amino dalam emzim atau protein mikroorganisme. 4) Formaldehida 8 % merupakan konsentrasi yang cukup ampuh untuk mematikan sebagian besar mikroorganisme. Daya kerjanya adalah berkaitan dengan amino dalam protein mikrobia. 5) Gas etilen oksida, gas ini digunakan terutama untuk mensterilkan bahan yang dibuat dari plastik.

Sterilisasi dengan bahan kimia digunakan alkohol 70 %. Menurut Gupte (1990), etil alkohol sangan efektif pada kadar 70 % daripada 100 % dan ini tidak membunuh spora. Sterilisasi dengan alkohol dilakukan pada proses pembuatan kultur stok dan teknik isolasi. Alkohol 70 % disemprotkan pada tangan praktikan dan alat-alat seperti makropipet dan mikropipet. Menurut Volk dan Wheeler (1988), alkohol bila digunakan pada kulit kontaknya terlalu pendek untuk menimbulkan banyak efek germisida dan alkohol segera menguap karena sifatnya mudah menguap. Namun alkohol dapat menyingkirkan minyak, partikel debu, dan bakteri. Menurut Gupte (1990), alkohol 70 % dapat menyebabkan denaturasi protein dan koagulaasi.

Daftar Pustaka

Fardiaz, Srikandi. 1992.Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. PAU Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor.

Lay, B. W. dan Hastowo. 1982.Mikrobiologi. Rajawali Press Jakarta.

Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT.Gramedia.Jakarta.

Volk, W.A. dan Wheeler, M.F. 1988. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga. Jakarta